中波紫外线影响大鼠表皮角朊细胞p53蛋白及p21蛋白表达的研究
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作者：徐兵 涂平 马圣清 武玲慎
单位：100034 北京医科大学第一临床学院皮肤科[徐兵(现在青岛医学院附属第二医院皮肤科，266042) 涂平(指导者) 马圣清(指导者) 武玲慎]
关键词：紫外线；角蛋白细胞；蛋白质p53；癌基因蛋白质p21
中华皮肤科杂志980611 【摘要】 目的 探讨表皮角朊细胞对抗中波紫外线(UVB)损伤和致癌的机制。方法 采用LSAB免疫组化方法，测定UVB照射后大鼠正常表皮p53蛋白及p21蛋白表达。结果 UVB单次照射后4小时即能测到p53蛋白表达，第8小时左右达到峰值，72小时后消失；p21蛋白出现时间与p53蛋白相同，但其消退较慢，第72小时仍能被检测到。两者染色主要位于表皮角朊细胞核内。结论 表皮角朊细胞可能是通过野生型p53蛋白和p21蛋白来对UVB导致表皮角朊细胞癌变起抑制作用。
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Coexpression of p53 and p21 in Rat Epidermal Keratinocytes Following UVB Irradiation Xu Bing, Tu Ping, Ma Shengqing, et al. Department of Dermatology, First Hospital, Beijing Medical University, Bejing, 100034
【Abstract】 Objective To investigate the function of p53 and p21 in epidermal keratinocytes following UVB irradiation. Methods Using immunohistochemical staining, the appearance of p53 protein and p21 was detected in the epidermis of rat after exposure to UVB irradiation. Results The positive reactivity to p53 protein was found at 4h following UVB irradiation, peaked at 8h and returned to undetectable level at 72h. The appearance of p21 protein was also observed at 4h, but disappeared a little later, and could still be detected at 72h. Conclusion UVB caused a rise in wildtype p53 protein levels, in association with induction of p21 in rat epidermal keratinocytes. The above data suggest that overexpression of wildtype p53 and p21 may play an important role in preventing the carcinogenesis from damage of UVB.
, 百拇医药
【Key words】 Ultraviolet rays Keratinocytes Protein p53 Oncogene protein p21
p53基因是抑癌基因，其编码的野生型p53蛋白对细胞正常生长、分化和增殖起着重要的调控作用，它能通过一系列严密的步骤来确保细胞内环境的稳定和核内基因组的完整，消除致癌因素的影响，避免癌变[1，2]。p53蛋白是激活p21基因表达p21蛋白完成上述生理功能的[3]。中波紫外线(UVB)是最常见的致癌因素，表皮癌与过度暴露日光中的UVB密切相关[4]。我们用免疫组化方法，对UVB照射前后大鼠正常表皮p53蛋白以及p21蛋白的表达进行了检测，旨在探讨表皮角朊细胞对抗UVB损伤和致癌机制。
材料和方法
(一)动物模型的建立：
1.动物：选体重约200g，2月龄，健康雄性白色大鼠(Waster Rat)20只，随机分组，第1组5只、第2组5只、第3组2只、第4组5只、第5组2只、第6组1只。剃毛，暴露背部皮肤4cm×6cm。
, 百拇医药
2.器材：德国惠民紫外光800k治疗仪(Waldman Lichttnik UV Therapy System, UV800k)，设4支UVB光管，功率20W，光谱范围：285～350nm，峰值波段是310～315nm。该公司紫外光光强测试器(UV米表)。
3.单次UVB照射：用UV米表测试UVB光强为0.50mW/cm2，1～6组照射剂量为80mJ/cm2、100mJ/cm2、120mJ/cm2、150mJ/cm2、200mJ/cm2和250mJ/cm2，计算出各组照射时间依次为：160秒、200秒、240秒、300秒、400秒和500秒。照射时遮盖大鼠背部部分皮肤作自身对照。
4.取材：在照射和对称的非照射区，分别于照射前及照射后2、4、8、12、24、48、72小时用4mm环钻取皮，置于-30℃冰箱保存。
, 百拇医药
(二)试剂：均由北京中山生物技术公司购进。过氧化物酶标记的链霉亲和素免疫组化染色试剂盒(简称SPTM试剂盒，批号：多抗，SP9001)系美国Zymed公司产品。兔抗p53蛋白多克隆抗体CM-1系英国Castra Laboratories公司产品。兔抗p21蛋白多克隆抗体C-19系英国Santa Cruz生物技术公司产品。1% BSA-PBS系北京中山生物技术公司产品。
(三)制片与染色：载玻片以APES处理，OCT包埋标本作冰冻切片，厚5μm，每份标本连续切片，分别作p53、p21免疫组化染色。每批标本都用已知阳性的人Bowen病标本作为p53阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。采用HRP标记的链霉亲和素-生物素LSAB法染色。逐步稀释抗p53及抗p21抗体的浓度，以照射前大鼠正常表皮标本阴性染色的浓度为工作浓度。UVB照射后72小时的标本同时加作HE染色。
(四)结果判断：由两名观察者相互独立完成，核内见到黄色或棕黄色颗粒沉着者为阳性细胞。每张切片在高倍镜(400×)下随机选择5个含表皮的视野，计数每个视野中阳性细胞数，综合两观察者的结果，取平均数作为该标本平均阳性细胞数。
, 百拇医药
结 果
(一)UVB照射前、照射后2小时、72小时以及各时间点的自身对照均为阴性。p21蛋白与p53蛋白基本相同。
(二)经UVB照射，绝大部分大鼠在第4、8、12、24、48小时出现p53阳性细胞，具体数据见附表。p21蛋白表达的情况与p53蛋白基本相同，只是照射后72小时仍有少量p21蛋白表达，故具体数据从略。在80～250mJ/cm2范围内，未发现p53和p21蛋白表达与UVB有明显的量效关系。
附表 各组大鼠UVB照射前后各时间点的每高倍镜下p53阳性细胞均数 分组
照射前
照射后
2h
4h
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8h
12h
24h
48h
72h
80mJ组
-
-
6.36±4.44
11.04±0.74
9.96±2.53
6.52±2.44
0.4±0.8
, 百拇医药
-
100mJ组
-
-
7.06±4.73
8.06±4.41
14.50±5.62
7.24±3.89
-
-
120mJ组
-
-
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3.50±0.50
4.95±0.85
5.10±3.10
4.55±1.55
-
-
150mJ组
-
-
6.88±3.11
10.56±6.48
7.80±2.85
, 百拇医药
8.76±4.66
0.16±0.32
-
200mJ组
-
-
3.70±1.70
13.45±7.05
6.70±0.50
7.90±4.30
-
-
250mJ组
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-
-
2.60
12.40
8.6
3.2
-
-
(三)p53蛋白和p21蛋白主要位于大鼠表皮角朊细胞的核内，核外及真皮组织中未发现两者的阳性表达。
(四)经UVB照射后72小时的标本HE染色均未见异型增生细胞。
讨 论
结果显示一定剂量的UVB能刺激大鼠正常表皮一过性表达p53蛋白，部位在角朊细胞核内。因UVB造成基因突变需要一个较长的积累过程，本实验中各剂量UVB单次短时间照射很难引起基因突变，HE染色表皮和真皮均未见异型增生细胞，所以检测到的p53蛋白不可能是突变型，而只能是野生型。一过性p53蛋白水平升高的动态变化过程本身也提示它是能完成其生理功能的野生型p53蛋白。有研究证明，野生型p53蛋白能够激活p21基因，表达p21蛋白，以阻止细胞分裂，防止DNA损伤传给下一代细胞，消除细胞癌变；突变型p53蛋白则不能激活p21基因而丧失正常功能[3，5]。本实验同时检测出p21蛋白过度表达，进一步说明本实验所检测到的p53蛋白是野生型。实验未发现大鼠真皮内有细胞表达p53蛋白，说明UVB直接照射皮肤影响p53蛋白表达的作用仅限于表皮。这与Campbell等[6]实验结果一致，原因可能是由于UVB的穿透力较弱，仅造成表皮角朊细胞DNA损伤。本实验未发现p53蛋白和p21蛋白表达与UVB有明显量效关系，可能与标本数较少和(或)大鼠的个体差异有关。
, 百拇医药
有研究发现表皮癌中相当比例伴有p53蛋白的过量表达，尤日光暴露部位者为著，以往曾认为p53蛋白过度表达提示p53基因突变[7]，但近来多项研究显示确实存在p53基因突变的仅占少部分[8]。这种p53蛋白表达与p53基因突变的“分离现象”令人费解。依据本文结果，我们推断以往文献中报道日光暴露部位仅有p53蛋白过度表达而无p53基因突变的表皮癌中，可能存在野生型p53过度表达。可能是由于致癌因子造成DNA损伤的信息激活了内源性p53基因过度表达野生型p53蛋白，以抑制角朊细胞异常增生和修复受损的DNA，因此这是角朊细胞一种自我保护性机制的表现。
虽然本研究结果有助于了解野生型p53蛋白和p21蛋白对UVB导致表皮角朊细胞癌变的抑制作用，但仍是初步的，UVB等致癌因素影响表皮p53蛋白、p21蛋白过度表达的机制以及日光暴露部位表皮癌中是否存在野生型p53过度表达仍需要分子生物学等方面的进一步研究证实。
国家教委青年归国人员基金课题，西安杨森皮肤科学教育和研究基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1 Vogelstein B, Kinzler KW. p53 function and dysfunction. Cell, 1992, 70∶523-526.
2 Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumour suppressor gene. Nature, 1991,351∶453-456.
3 Petrocelli T, Poon R, Drucker DJ, et al. UVB radiation induces p21Cip1 /WAF1 and mediates G1 and S phase checkpoints. Oncogene, 1996,12∶1387-1396.
4 Drobetsky EA, Grosovsky AT, Glickman BW. The specificity of UV induced mutations at an endogenous locus in mammalian cell. Proc Natl Acad Sci USA, 1987,84∶9103-9107.
, 百拇医药
5 Inohara S, Kitagawak, Kitano Y. Coexpression of p21Waf1/Cip1 and p53 in sun-exposed normal epidermis, but not in neoplastio epidermis. Br J Dermatol, 1996,135∶717-720.
6 Campbell C, Quinn AG, Angus B, et al. Wavelength specific patterns of p53 induction in human skin following exposure to UV radiation. Cancer Res, 1993,53∶2697-2699.
7 Campbell C, Quinn AG, Angus B, et al. The relation between p53 mutation and p53 immunostaining in non-melanoma skin cancer. Br J Dermatol, 1993,129∶235-241.
8 Urano Y, Asano T, Yoshimoto K, et al. Frequent p53 accumulation in the chronically sun-exposed epidermis and clonal expansion of p53 mutant cell in the epidermis adjacent to basal cell carcinoma. J Invest Dermatol,1995,104∶928-932.
(收稿：1997-11-03 修回：1998-05-11), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一临床学院皮肤科[徐兵(现在青岛医学院附属第二医院皮肤科，266042) 涂平(指导者) 马圣清(指导者) 武玲慎]
关键词：紫外线；角蛋白细胞；蛋白质p53；癌基因蛋白质p21
中华皮肤科杂志980611 【摘要】 目的 探讨表皮角朊细胞对抗中波紫外线(UVB)损伤和致癌的机制。方法 采用LSAB免疫组化方法，测定UVB照射后大鼠正常表皮p53蛋白及p21蛋白表达。结果 UVB单次照射后4小时即能测到p53蛋白表达，第8小时左右达到峰值，72小时后消失；p21蛋白出现时间与p53蛋白相同，但其消退较慢，第72小时仍能被检测到。两者染色主要位于表皮角朊细胞核内。结论 表皮角朊细胞可能是通过野生型p53蛋白和p21蛋白来对UVB导致表皮角朊细胞癌变起抑制作用。
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Coexpression of p53 and p21 in Rat Epidermal Keratinocytes Following UVB Irradiation Xu Bing, Tu Ping, Ma Shengqing, et al. Department of Dermatology, First Hospital, Beijing Medical University, Bejing, 100034
【Abstract】 Objective To investigate the function of p53 and p21 in epidermal keratinocytes following UVB irradiation. Methods Using immunohistochemical staining, the appearance of p53 protein and p21 was detected in the epidermis of rat after exposure to UVB irradiation. Results The positive reactivity to p53 protein was found at 4h following UVB irradiation, peaked at 8h and returned to undetectable level at 72h. The appearance of p21 protein was also observed at 4h, but disappeared a little later, and could still be detected at 72h. Conclusion UVB caused a rise in wildtype p53 protein levels, in association with induction of p21 in rat epidermal keratinocytes. The above data suggest that overexpression of wildtype p53 and p21 may play an important role in preventing the carcinogenesis from damage of UVB.
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【Key words】 Ultraviolet rays Keratinocytes Protein p53 Oncogene protein p21
p53基因是抑癌基因，其编码的野生型p53蛋白对细胞正常生长、分化和增殖起着重要的调控作用，它能通过一系列严密的步骤来确保细胞内环境的稳定和核内基因组的完整，消除致癌因素的影响，避免癌变[1，2]。p53蛋白是激活p21基因表达p21蛋白完成上述生理功能的[3]。中波紫外线(UVB)是最常见的致癌因素，表皮癌与过度暴露日光中的UVB密切相关[4]。我们用免疫组化方法，对UVB照射前后大鼠正常表皮p53蛋白以及p21蛋白的表达进行了检测，旨在探讨表皮角朊细胞对抗UVB损伤和致癌机制。
材料和方法
(一)动物模型的建立：
1.动物：选体重约200g，2月龄，健康雄性白色大鼠(Waster Rat)20只，随机分组，第1组5只、第2组5只、第3组2只、第4组5只、第5组2只、第6组1只。剃毛，暴露背部皮肤4cm×6cm。
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2.器材：德国惠民紫外光800k治疗仪(Waldman Lichttnik UV Therapy System, UV800k)，设4支UVB光管，功率20W，光谱范围：285～350nm，峰值波段是310～315nm。该公司紫外光光强测试器(UV米表)。
3.单次UVB照射：用UV米表测试UVB光强为0.50mW/cm2，1～6组照射剂量为80mJ/cm2、100mJ/cm2、120mJ/cm2、150mJ/cm2、200mJ/cm2和250mJ/cm2，计算出各组照射时间依次为：160秒、200秒、240秒、300秒、400秒和500秒。照射时遮盖大鼠背部部分皮肤作自身对照。
4.取材：在照射和对称的非照射区，分别于照射前及照射后2、4、8、12、24、48、72小时用4mm环钻取皮，置于-30℃冰箱保存。
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(二)试剂：均由北京中山生物技术公司购进。过氧化物酶标记的链霉亲和素免疫组化染色试剂盒(简称SPTM试剂盒，批号：多抗，SP9001)系美国Zymed公司产品。兔抗p53蛋白多克隆抗体CM-1系英国Castra Laboratories公司产品。兔抗p21蛋白多克隆抗体C-19系英国Santa Cruz生物技术公司产品。1% BSA-PBS系北京中山生物技术公司产品。
(三)制片与染色：载玻片以APES处理，OCT包埋标本作冰冻切片，厚5μm，每份标本连续切片，分别作p53、p21免疫组化染色。每批标本都用已知阳性的人Bowen病标本作为p53阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。采用HRP标记的链霉亲和素-生物素LSAB法染色。逐步稀释抗p53及抗p21抗体的浓度，以照射前大鼠正常表皮标本阴性染色的浓度为工作浓度。UVB照射后72小时的标本同时加作HE染色。
(四)结果判断：由两名观察者相互独立完成，核内见到黄色或棕黄色颗粒沉着者为阳性细胞。每张切片在高倍镜(400×)下随机选择5个含表皮的视野，计数每个视野中阳性细胞数，综合两观察者的结果，取平均数作为该标本平均阳性细胞数。
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结 果
(一)UVB照射前、照射后2小时、72小时以及各时间点的自身对照均为阴性。p21蛋白与p53蛋白基本相同。
(二)经UVB照射，绝大部分大鼠在第4、8、12、24、48小时出现p53阳性细胞，具体数据见附表。p21蛋白表达的情况与p53蛋白基本相同，只是照射后72小时仍有少量p21蛋白表达，故具体数据从略。在80～250mJ/cm2范围内，未发现p53和p21蛋白表达与UVB有明显的量效关系。
附表 各组大鼠UVB照射前后各时间点的每高倍镜下p53阳性细胞均数 分组
照射前
照射后
2h
4h
, 百拇医药
8h
12h
24h
48h
72h
80mJ组
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6.36±4.44
11.04±0.74
9.96±2.53
6.52±2.44
0.4±0.8
, 百拇医药
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100mJ组
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7.06±4.73
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14.50±5.62
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120mJ组
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3.50±0.50
4.95±0.85
5.10±3.10
4.55±1.55
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150mJ组
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6.88±3.11
10.56±6.48
7.80±2.85
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8.76±4.66
0.16±0.32
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200mJ组
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3.70±1.70
13.45±7.05
6.70±0.50
7.90±4.30
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2.60
12.40
8.6
3.2
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(三)p53蛋白和p21蛋白主要位于大鼠表皮角朊细胞的核内，核外及真皮组织中未发现两者的阳性表达。
(四)经UVB照射后72小时的标本HE染色均未见异型增生细胞。
讨 论
结果显示一定剂量的UVB能刺激大鼠正常表皮一过性表达p53蛋白，部位在角朊细胞核内。因UVB造成基因突变需要一个较长的积累过程，本实验中各剂量UVB单次短时间照射很难引起基因突变，HE染色表皮和真皮均未见异型增生细胞，所以检测到的p53蛋白不可能是突变型，而只能是野生型。一过性p53蛋白水平升高的动态变化过程本身也提示它是能完成其生理功能的野生型p53蛋白。有研究证明，野生型p53蛋白能够激活p21基因，表达p21蛋白，以阻止细胞分裂，防止DNA损伤传给下一代细胞，消除细胞癌变；突变型p53蛋白则不能激活p21基因而丧失正常功能[3，5]。本实验同时检测出p21蛋白过度表达，进一步说明本实验所检测到的p53蛋白是野生型。实验未发现大鼠真皮内有细胞表达p53蛋白，说明UVB直接照射皮肤影响p53蛋白表达的作用仅限于表皮。这与Campbell等[6]实验结果一致，原因可能是由于UVB的穿透力较弱，仅造成表皮角朊细胞DNA损伤。本实验未发现p53蛋白和p21蛋白表达与UVB有明显量效关系，可能与标本数较少和(或)大鼠的个体差异有关。
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有研究发现表皮癌中相当比例伴有p53蛋白的过量表达，尤日光暴露部位者为著，以往曾认为p53蛋白过度表达提示p53基因突变[7]，但近来多项研究显示确实存在p53基因突变的仅占少部分[8]。这种p53蛋白表达与p53基因突变的“分离现象”令人费解。依据本文结果，我们推断以往文献中报道日光暴露部位仅有p53蛋白过度表达而无p53基因突变的表皮癌中，可能存在野生型p53过度表达。可能是由于致癌因子造成DNA损伤的信息激活了内源性p53基因过度表达野生型p53蛋白，以抑制角朊细胞异常增生和修复受损的DNA，因此这是角朊细胞一种自我保护性机制的表现。
虽然本研究结果有助于了解野生型p53蛋白和p21蛋白对UVB导致表皮角朊细胞癌变的抑制作用，但仍是初步的，UVB等致癌因素影响表皮p53蛋白、p21蛋白过度表达的机制以及日光暴露部位表皮癌中是否存在野生型p53过度表达仍需要分子生物学等方面的进一步研究证实。
国家教委青年归国人员基金课题，西安杨森皮肤科学教育和研究基金资助项目
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参考文献
1 Vogelstein B, Kinzler KW. p53 function and dysfunction. Cell, 1992, 70∶523-526.
2 Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumour suppressor gene. Nature, 1991,351∶453-456.
3 Petrocelli T, Poon R, Drucker DJ, et al. UVB radiation induces p21Cip1 /WAF1 and mediates G1 and S phase checkpoints. Oncogene, 1996,12∶1387-1396.
4 Drobetsky EA, Grosovsky AT, Glickman BW. The specificity of UV induced mutations at an endogenous locus in mammalian cell. Proc Natl Acad Sci USA, 1987,84∶9103-9107.
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5 Inohara S, Kitagawak, Kitano Y. Coexpression of p21Waf1/Cip1 and p53 in sun-exposed normal epidermis, but not in neoplastio epidermis. Br J Dermatol, 1996,135∶717-720.
6 Campbell C, Quinn AG, Angus B, et al. Wavelength specific patterns of p53 induction in human skin following exposure to UV radiation. Cancer Res, 1993,53∶2697-2699.
7 Campbell C, Quinn AG, Angus B, et al. The relation between p53 mutation and p53 immunostaining in non-melanoma skin cancer. Br J Dermatol, 1993,129∶235-241.
8 Urano Y, Asano T, Yoshimoto K, et al. Frequent p53 accumulation in the chronically sun-exposed epidermis and clonal expansion of p53 mutant cell in the epidermis adjacent to basal cell carcinoma. J Invest Dermatol,1995,104∶928-932.
(收稿：1997-11-03 修回：1998-05-11), 百拇医药